最新研究成果 RDS，可体外抑制新冠、非典及甲型肝炎病毒感染

A traditional medicine, respiratory detox shot (RDS), inhibits the infection of SARS-CoV, SARS-CoV-2, and the influenza A virus in vitro

Brian Hetrick1, Dongyang Yu2, Adeyemi A. Olanrewaju1, Linda D. Chilin1, Sijia He1, Deemah Dabbagh1,Ghaliah Alluhaibi1, Yuan - Chun Ma3, Lewis A. Hofmann4, Ramin M. Hakami1 and Yuntao Wu1*

▋简要

取材：目前于是以肆虐全球的新型冠状大肠杆菌病 (SARS-CoV-2) 已在 220 多个国家所和区域大大行其道，截至 2021 年 4 月末已所致激过 1.28 亿人细菌感染，激过 280 万人被害。近期，尚待可适当增加 COVID-19 存已逝率的用药方式。我们研究工作了一种传统习俗的制剂口服制剂——欲求肺毒口服液 (RDS) 的潜在抗病毒冠状大肠杆菌已逝功能性，该口服液主要组分为东方临床传统习俗中都可用用药气管道传染病的中都中草药。

结果：RDS 消除 SARS-CoV 慢速大肠杆菌、SARS-CoV-2 慢速大肠杆菌、混杂病毒功能性大肠杆菌-SARS-CoV-2(Ha-CoV-2) 实为型大肠杆菌以及传染功能性 SARS-CoV-2 和共通的 Ha-CoV-2 兰花大肠杆菌 (B.1.1.7、B.1.351、P.1、B.1.429、B.1.2、B.1.494、B.1.1.207、B.1.258 和 B.1.1.298) 对内皮巨炎细胞的细菌感染。我们大幅度确实了 RDS 可以反之亦然灭已逝 SARS-CoV-2 大肠杆菌基质的传染功能性。此外，我们推测 RDS 还可截断病毒功能性肺炎大肠杆菌对内皮巨炎细胞的细菌感染。

结论：RDS 可相当多消除气管道大肠杆菌细菌感染。关键词：SARS-CoV-2，COVID-19，冠状大肠杆菌，抗病毒大肠杆菌用药，欲求肺毒口服液，传统习俗制剂，SARS-CoV，病毒功能性肺炎，Ha-CoV-2，SARS-CoV-2 实为型大肠杆菌

▋取材

目前于是以肆虐全球的新型冠状大肠杆菌病 (SARS-CoV-2) 已在 220 多个国家所和区域大大行其道，截至 2021 年 4 月末已所致激过 1.28 亿人细菌感染，激过 280 万人被害。近期，尚待可适当增加 COVID-19 存已逝率的用药方式。新显现出的 COVID-19 大肠杆菌病原体为冠状大肠杆菌 SARS-CoV-2[1]，是 SARS-CoV 在不堪重负急功能性气管综合征特别冠状大肠杆菌种类中都的姊妹大肠杆菌[2,3]。SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 最初都是在中都国推测的；SARS-CoV 大肠杆菌于 2002 年 11 月末在广东省首次被推测[4-6]，SARS-CoV-2 则于 2019 年 12 月末在武汉首次被推测[1,7,8]。在中都国，这两次由冠状大肠杆菌引起的疫情中都，制剂原则上被相当多应用于，主要用途紧急遏制冠状大肠杆菌引起的传染病。对于近期的 COVID-19 大大行其道，中都国有激过 85% 的 SARS-CoV-2 细菌感染患者接受了传统习俗中都医药疗法（9，10）。许多应用于的制剂是否有着适当的抗病毒冠状大肠杆菌物理功能性质并在诊断上是否适当，这个重要问题未曾得到更进一步答复。

制剂作为用药冠状大肠杆菌所引发传染病的适当疗法，但由于欠缺精子或人体内的系统研究工作，其发展与合理应用于原则上受到了阻碍。为了相符制剂的潜在抗病毒 SARS-CoV-2 已逝功能性，我们从常用制剂中都抽样了多种中草药精油，并从制剂口服液 RDS(澳大利亚一种于是以因如此药品膳食) 中都推测了抗病毒 SARS-CoV 和抗病毒 SARS-CoV-2 大肠杆菌的已逝功能性，一种在澳大利亚的零售业药品膳食。RDS 可用减慢人体气管系统的总体卫生，其构成多种中草药组分，如大豆和荆芥，它们是传统习俗上可用管控增生和气管道传染病的中都中草药 (11-13)。在此，我们路透社 RDS 对 SARS-CoV、SARS-CoV-2 实为大肠杆菌以及有着细菌感染功能性的野生型 SARS-CoV-2 大肠杆菌对内皮巨炎细胞的细菌感染有着消除作用。我们大幅度确实 RDS 可通过反之亦然灭已逝大肠杆菌基质或阻挠大肠杆菌进犯而消除大肠杆菌的后期细菌感染延迟。此外，我们推测 RDS 还可以阻挠的大流大肠杆菌对内皮巨炎细胞的细菌感染。这些结果指出，RDS 对气管道大肠杆菌的细菌感染或许有着相当多的消除作用。

▋结果

为了从传统习俗中都中草药中都找到潜在的抗病毒 SARS-CoV-2 已逝功能性，我们从约四十种传统习俗中草药中都抽样所含出 SARS-CoV-2S 酶实为型慢速大肠杆菌[14,15] 和人体气管道 A549(ACE2) 内皮巨炎细胞，此本能 ACE2 基因就会通过慢速大肠杆菌转导作为核醛介导，从而稳定转导来实现激对此。慢速实为型大肠杆菌应用于绿色荧光酶 (GFP) 或荧光效酶 (Luc) 作为路透社基因，并通过了有着广谱抗病毒大肠杆菌转到消除剂，以及曼尼帕拉 (Arbidol)[16]，和本能抗病毒毒血清对抗病毒 SARS-CoV-2(上图 1a、C) 的验证。我们必须最终样品到曼尼帕拉 (Arbidol) 和抗病毒毒血清对于 SARS-CoV-2 实为型大肠杆菌的消除作用，这是我们在其他四十余种传统习俗中草药精油测试中都并未推测的，除此以外其中都一些发挥作用较低有毒的中草药 (上图 1a-C)。然而，鉴于慢速功能性实为型大肠杆菌仅仅能样品 SARS-CoV-2 大肠杆菌的进犯行为，我们不能排除这些中草药精油或许有在转到后阶段必须消除 SARS-CoV-2 的或许功能性。我们大幅度从传统习俗本品欲求肺毒口服液 (RDS) 中都抽样出了或许的抗病毒 SARS-CoV-2 已逝功能性，该商品所含九种中草药组分——、茎叶、大豆、荆芥、玄参、苦杏仁、蜂房、皂角、醋，在中都国传统习俗上可用用药气管道传染病 (11-13)。

所含的大基饮料醛、3，4-二邻饮料苯基适当成分醛、的大基 3，4-二邻饮料苯基适当成分醛、原儿茶醛、的大基绿原醛和木犀草效；花蕾中都还所含共通物 A、B 和 10 种推断环共通物醚单糖共通物[17]；该真菌还所含皂甙甙 A 和 B，以及抗病毒增生作用的共通物 C[18,19]。茎叶吡啶共通物中都所含木脂效、松脂醇和茎叶共通物[20]。大豆中都所含被称为大豆皂共通物的甾体皂共通物，是大豆旧称真菌近似于的真菌化学物质[21,22]。细叶荆芥中都主要已逝功能性组分为四种单单糖，(−)-香草酮、(+)-特博利厄酮、(−)-柠檬共通物和 (+)-香草噻唑；这种真菌还所含其他有机化合物，如 1-辛共通物-3-醇、3-辛酮、β-月末桂共通物和β-石竹共通物[23]。玄参所含激过 162 种有机化合物，除此以外环共通物醚单糖和环共通物醚单糖共通物、苯丙共通物、有机醛、单糖类、糖类、黄酮类、和皂共通物[24]。苦杏仁中都所含酚类、氰基有机化合物和果胶多糖[25]。皂角刺中都所含皂共通物和羽扇豆醛[26,27]，而醋中都所含主要已逝功能性组分醋醛[28]。为了大幅度测试 RDS 的抗病毒 SARS-CoV-2 已逝功能性，用相同液态ppm的 RDS 模板 A549(ACE2) 巨炎细胞，然后让这些巨炎细胞在发挥作用 RDS 的意味著接受 4-6 每隔的细菌感染。细菌感染后，在不发挥作用 RDS 的意味著养成巨炎细胞，然后在 48 和 72 每隔的时候，通过流双管巨炎细胞练成对大肠杆菌细菌感染的消除作用顺利进行二阶。为了管控巨炎细胞有毒，应用于的大醛丙啶 (PI) 对刚被害和已被害的巨炎细胞顺利进行上色，仅仅在已逝巨炎细胞群中都比对 GFP+巨炎细胞。如上图 2 附注，我们检视到 RDS 对 SARS-CoV-2(GFP) 实为大肠杆菌有着口服反之亦然消除作用。为了推测这些结果，我们应用于内源功能性对此 ACE2 的 VeroE6 巨炎细胞便是类推了该细菌感染实验者。

(见下页上图)

ACE2 内部对此，生产功能性 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 大肠杆菌可对其顺利进行细菌感染，ACE2 通常可用冠状大肠杆菌的研究工作 (7)。考虑到在欠缺 ACE2 激对此 [15，29，30] 的意味著，实为型大肠杆菌对 VeroE6 的细菌感染功能性较低，我们还应用于了荧光效酶路透社基因实为型大肠杆菌，该大肠杆菌的路透社基因对此由 HIV-1LTR 和 Tat 驱动，有着更高的路透社基因诱发和信噪比。

上图 2：RDS 消除 SARS-CoV-2(GFP) 实为型大肠杆菌细菌感染 A549(ACE2) 巨炎细胞。

A.A549(ACE2) 巨炎细胞用 RDS 近十年液态 30 分钟后，用 SARS-CoV-2(GFP) 实为型大肠杆菌细菌感染。将巨炎细胞沾去大肠杆菌和 RDS，并在不发挥作用 RDS 的意味著顺利进行养成。流双管巨炎细胞祯样品大肠杆菌细菌感染消除情况。未细菌感染的巨炎细胞和细菌感染 SARS-CoV-2(GFP) 但擅自 RDS 用药的巨炎细胞作为对应。GFP+巨炎细胞百分比已显示。(PI) 的大醛丙啶。

B.RDS 的巨炎细胞有毒一原理。A549(ACE2) 巨炎细胞用 RDS 近十年液态 4 每隔，沾去 RDS，无 RDS 养成 48 每隔。的大醛丙啶上色鉴定于是以在被害巨炎细胞和已被害巨炎细胞，流双管巨炎细胞练组比对。绘制口服-催化巨炎细胞有毒曲线，RDS 的半染病ppm (LC50) 比例为 1:11.9。

如上图 3A 附注，我们应用于 Luc 简报基因实为大肠杆菌和 VeroE6 巨炎细胞顺利进行细菌感染实验者，检视到 RDS 对该大肠杆菌细菌感染有着口服反之亦然消除作用，并且分之三消除ppm相符为 1:230RDS 液态度 (上图 3B)。我们还二阶了 RDS 对 VeroE6 巨炎细胞已逝力的影响，相符了 50% 巨炎细胞被害口服为 1:11.8RDS 液态度。

上图 3：RDS 对 SARS-CoV-2(Luc) 实为大肠杆菌和野生型 SARS-CoV-2 大肠杆菌的口服反之亦然消除消除作用。用 RDS 近十年液态模板 A、BVeroE6 巨炎细胞，并用 SARS-CoV-2(Luc) 实为型大肠杆菌细菌感染。将巨炎细胞沾去大肠杆菌和 RDS，并在不发挥作用 RDS 的意味著顺利进行养成。在细菌感染后 72 每隔用荧光效酶样品大肠杆菌细菌感染的消除作用。未细菌感染巨炎细胞和 SARS-CoV-2-luc 细菌感染但擅自过 RDS 用药的巨炎细胞作为对应。实验者便是类推三次。绘制口服催化曲线和 RDS 的 I-C50 液态比例为 1:230。CRDS 对 VeroE6 巨炎细胞的巨炎细胞有毒也通过的大醛丙啶上色和流双管巨炎细胞练成一原理。用 RDS 近十年液态 4 每隔，沾去 RDS，在不含 RDS 的意味著养成 72 每隔。绘制巨炎细胞有毒口服-催化曲线，RDS 的半染病ppm (LC50) 比例为 1:13.8 液态。DRDS 消除传染功能性 SARS-CoV-2 细菌感染。用近十年液态的 RDS 模板 VeroE6 巨炎细胞，并在 RDS 发挥作用的意味著细菌感染 SARS-CoV-2。细菌感染 48 每隔后，通过炎菌斑比对大肠杆菌释放后的大肠杆菌激已逝消除情况。消除测试一双管二分顺利进行，并在 Prism7(Graph Pad) 中都应用于单向绝对值 (One-Way ANOVA) 比对及 Dunnett 后验 (Dunnett's Post Test)，便是相符统计显着功能性。异质功能性值用星号对此如下：*p

为了大幅度验证应用于实为大肠杆菌获得的结果，我们测试了 RDS 对于 SARS-CoV-2 细菌感染的截断传染功能性能力。如上图 3D 附注，RDS 同时也截断了 SARS-CoV-2 对 VeroE6 巨炎细胞的细菌感染。RDS 在液态 1:40 以上时可显著减少大肠杆菌深褐色的过渡到。

综上，通过 SARS-CoV-2 实为大肠杆菌与传染功能性大肠杆菌的结果指出，RDS 所含消除 SARS-CoV-2 细菌感染的已逝功能性组分，或许是通过反之亦然灭已逝大肠杆菌或截断大肠杆菌的后期细菌感染延迟。

为大幅度研究工作或许的组态，我们将传染功能性 SARS-CoV-2 大肠杆菌基质与近十年液态的 RDS 在 37°C 下预养成 1 每隔。随后，将液态大幅度依次液态-(10–1 至 10–4)，并自组 Vero 巨炎细胞顺利进行炎菌斑比对以相符大肠杆菌细菌感染功能性的增加。如上图 4A 附注，我们检视到在 RDS 中都短暂去除一每隔后的大肠杆菌基质，其 SARS-CoV-2 的细菌感染效价也黄绿色口服反之亦然下降。该结果推测了 RDS 可适当反之亦然灭已逝 SARS-CoV-2 大肠杆菌基质的传染功能性。

我们大幅度测试了 RDS 是否也能消除 SARS-CoV-2 大肠杆菌兰花的细菌感染。为此，我们利用最近开发的混杂的大大肠杆菌-SARS-CoV-2 实为型大肠杆菌 (Ha-CoV-2)[31] 来合成一第三部 S 酶则有，除此以外苏格兰则有 (B.1.1.7)，南非则有 (B.1.351)，巴西则有 (P.1)，加州则有 (B.1.429)，和其他几个新兴则有 (B.1.2，B.1.494，B.1.1.207B.1.258，B.1.1.298)。Ha-CoV-2(Luc) 和特别 S 酶相异体在 37°C 近十年液态 RDS 养成 1 每隔。随后，用该液态细菌感染 HEK293T(ACE2/TMPRESS2) 内皮巨炎细胞。细菌感染后 12 每隔，荧光效酶推算出大肠杆菌细菌感染的消除作用。如上图 4B 附注，我们还检视到了 RDS 对 Ha-CoV-2(Luc) 和所有 S 酶则有的口服反之亦然消除。

我们还测试了 RDS 截断 SARS-CoV 细菌感染的能力，应用于略带 SARS-CoV 突刺酶的 GFP 路透社基因慢速大肠杆菌和[15] 实为口服。我们将人 A549(ACE2) 巨炎细胞用作内皮巨炎细胞，将其用第三部液态的 RDS 模板，然后用 SARS-CoV(GFP) 简报基因实为大肠杆菌细菌感染 4-6 每隔。细菌感染后在不含 RDS 的意味著养成巨炎细胞，流双管巨炎细胞练成二阶样品其对大肠杆菌细菌感染的消除作用。同样，应用于的大醛丙啶排除于是以在被害与已被害的巨炎细胞，仅仅在已逝巨炎细胞群中都比对 GFP+巨炎细胞。如上图 5A 附注，我们检视到 RDS 对 SARS-CoV(GFP) 实为型大肠杆菌的消除作用黄绿色口服反之亦然。我们大幅度推测了这些结果，并二阶了 RDS 介导的消除与 Luc 路透社基因 SARS-CoV 实为型大肠杆菌，SARSCoV(Luc)。我们检视到 RDS 对 SARS-CoV(Luc) 和的消除作用黄绿色口服功能性依赖，其半消除ppm (IC50) 为 1:70.88 液态度 (上图 5B，C)。考虑到 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 都应用于 ACE2 细菌感染内皮巨炎细胞，我们还测试了 RDS 的抗病毒大肠杆菌已逝功能性是否仅仅针对与 ACE2 有电磁场的冠状大肠杆菌。为此，我们样品了一种不特别的负链 RNA 大肠杆菌便是病毒功能性肺炎大肠杆菌。它通过大肠杆菌血凝效 (HA) 和巨炎细胞α-唾液醛来细菌感染内皮巨炎细胞。为了合成病毒功能性肺炎大肠杆菌，将对此病毒功能性肺炎 A/WSN/33(H1N1) 基因组每个片段的 8 个核醛和一个 GFP-路透社基因共转染到 HEK293T 巨炎细胞中都。在 RDS 发挥作用的意味著，查阅大肠杆菌基质并可用细菌感染目标 MDCK 巨炎细胞。如上图 6A 附注，我们检视到 RDS 对病毒功能性肺炎大肠杆菌的消除作用黄绿色口服反之亦然。RDS 在 1:40 和 1:80 液态时可完全截断大肠杆菌细菌感染，在 1:160 液态人口为120人可部分消除病毒功能性肺炎。RDS 对 MDCK 巨炎细胞的半染病ppm (LC50) 经推算出为 1:18.5(上图 6B)。这些结果指出，RDS 的抗病毒大肠杆菌已逝功能性并非针对特定大肠杆菌，而或许必须相当多消除多种气管道大肠杆菌，如冠状大肠杆菌和病毒功能性肺炎大肠杆菌。

▋争论

在本简报中都，我们确实了传统习俗本品欲求肺毒口服液 (RDS) 所含广谱抗病毒大肠杆菌已逝功能性，可截断 SARS-CoV、SARSCoV-2 和病毒功能性肺炎大肠杆菌的细菌感染。虽然 RDS 必须消除多种大肠杆菌，但其抗病毒大肠杆菌已逝功能性因大肠杆菌一般来说和HIV而异。例如，对 SARS-CoV 慢速实为大肠杆菌的 I-C50 ppm为 1:7.9 液态度，对 SARS-CoV-2 慢速实为大肠杆菌的 I-C50 ppm为 1:230 液态度。对于传染功能性野生型 SARS-CoV-2 大肠杆菌，I-C50 为 1:40 液态度，对病毒功能性肺炎，其 I-C50 为 1:250。RDS 对 Ha-CoV-2 及其兰花有相同的消除作用，IC50 数值从 1:70 到 1:2601 液态度不等 (上图 4B)。

(见下一页上图)

上图 4 RDS 对 SARS-CoV-2 和共通的 Ha-CoV-2 兰花有着口服反之亦然灭已逝作用。ASARS-CoV-2 基质加近十年液态的 RDS 在 37°C 下养成 1 每隔。随后，将液态大幅度近十年液态，并自组 Vero 巨炎细胞中都顺利进行炎菌斑比对，以相符大肠杆菌细菌感染功能性增加。消除测试一双管二分顺利进行，并在 Prism7(GraphPad) 中都应用于单向绝对值 (One-WayANOVA) 比对和 Dunnett 后验 (Dunnett'sPostTest) 便是相符统计显着功能性。异质功能性值用星号对此如下：*p

BHa-CoV-2(Luc) 和特别 S 酶则有与近十年液态的 RDS 在 37°C 养成 1 每隔后，用液态细菌感染 HEK293T(ACE2/TMPRESS2) 内皮巨炎细胞。细菌感染后 12 每隔，荧光效酶推算出大肠杆菌细菌感染的消除作用。RDS 的 IC50 值的液态度为 1:177(wt)，1:828(B.1.1.7)，1:124(B.1.351)，1:88(P.1)，1:134(B.1.1.207)，1:2601(B.1.1.298)，1:70(B.1.258)，1:362(B.1.429)，1:163(B.1.494)，1:137(B.1.2)。

我们大幅度确实了 RDS 可以消除冠状大肠杆菌的后期细菌感染延迟。虽然就其的抗病毒大肠杆菌组态未曾正确，但 RDS 可以通过反之亦然灭已逝大肠杆菌基质或通过阻挠大肠杆菌进犯或截断大肠杆菌进犯后的后期延迟来阻挠大肠杆菌细菌感染。在其他几种传统习俗制剂中都也推测了抗病毒 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 的已逝功能性。例如，一种常见的传统习俗制剂——醋。

醋根中都已确实所含醋醛效，可消除 SARS 大肠杆菌[32] 诊断分离株的激已逝。此外，另一种可可用用药气管道传染病的制剂——双黄连制剂，已显示出在人体内以口服反之亦然方双管消除 SARS-CoV-23CL 酶酶 (3CLpro) 已逝功能性。凤仙花共通物和凤仙花效拟作为双黄连截断 3CLpro[33] 的适当组分。

上图 5 RDS 消除 SARS-CoV 实为型大肠杆菌对 A549(ACE2) 巨炎细胞的细菌感染。用近十年液态的 RDS 模板 A、B 巨炎细胞，用 SARS-CoV(GFP)(A) 或 SARSCoV(Luc)B 实为型大肠杆菌细菌感染。将巨炎细胞清沾，去掉大肠杆菌和 RDS，在不发挥作用 RDS 的意味著顺利进行养成。在细菌感染后 48 每隔和 72 每隔，通过流双管巨炎细胞练成或荧光效酶样品来一原理大肠杆菌细菌感染的消除作用。实验者便是类推三次。绘制口服响应曲线，并绘制 RDS 的 IC50 值为 1:70.9 液态度 (C)

上图 6 RDS 消除的大流大肠杆菌对 MDCK 巨炎细胞的细菌感染。(A) 用近十年液态的 RDS 模板 MDCK 巨炎细胞 30 分钟，然后用的大流大肠杆菌 (GFP) 对其顺利进行细菌感染。细菌感染后，在 RDS 发挥作用下养成巨炎细胞。36 每隔后用流双管巨炎细胞祯对大肠杆菌细菌感染的消除作用顺利进行一原理。把未细菌感染的巨炎细胞与被的大流大肠杆菌 (GFP) 细菌感染但擅自 RDS 执行的巨炎细胞顺利进行对比。上图中都显示了 GFP+巨炎细胞的百分比。PI 对此的大醛丙啶 PI。

(B) 另外还应用于了 MTT 推算出法一原理了 RDS 对 MDCK 巨炎细胞的有毒，绘制了巨炎细胞有毒的口服-催化曲线，经计算，RDS 的分之三染病ppm为 1:18.5 液态度 RDS 的适当抗病毒大肠杆菌组分未曾相符。然而，RDS 相同于凤仙花共通物和凤仙花效，RDS 可以通过反之亦然灭已逝大肠杆菌相对论功能性来截断大肠杆菌细菌感染 (上图 4)，而凤仙花共通物和凤仙花效则在大肠杆菌生命周期的后期通过截断大肠杆菌酶酶的已逝功能性来发挥作用。然而，RDS 的人体内抗病毒 SARS-CoV-2 已逝功能性仍需在今后的哺乳类研究工作和本能诊断测试中都得到推测。目前，我们于是以在顺利进行小型哺乳类实验者，以相符 RDS 在精子截断 SARS-CoV-2 大肠杆菌细菌感染的零售业价值。

▋结论

我们的研究工作指出，RDS 可相当多消除气管道大肠杆菌的细菌感染，如 SARS-CoV、SARS-CoV-2 和病毒功能性肺炎。

▋方式

巨炎细胞和巨炎细胞养成

HEK293T (ATCC 埃尔迪亚，密西西比州) MDCK (ATCC 埃尔迪亚，密西西比州)，VeroE6 (ATCC 埃尔迪亚，密西西比州) 和 A549 (ACE2) (来自 Virongy LLC 还给，埃尔迪亚，密西西比州)，和 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) (来自 Virongy LLC 还给，埃尔迪亚，密西西比州) 目前保留于 Dulbecco's modifiedEagle's medium (DMEM) (赛默飞世尔高科技 Thermo Fisher Scientific) 所含 10% 微灭已逝 FBS 和 1×口服-阿司匹林 (赛默飞世尔高科技 Thermo Fisher Scientific)。在 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) 巨炎细胞养成基中都分别以 1μg/ml 和 200μg/ml 的ppm自组嘌呤霉效和潮霉效 B。

核糖体转染和大肠杆菌合成

含 SARS-CoVS 酶或 SARS-CoV-2S 酶的慢速功能性实为型大肠杆菌基质由 Virongy LLC (Manassas，VA) 提供者，或按照左边描绘的方式[15] 合成。简言之，为了合成 GFP 路透社基因慢速功能性实为大肠杆菌，HEK293T 巨炎细胞与对此 SARS-CoVS 酶或 SARS-CoV-2S 酶的核醛、pCMVΔR8.2 和 pLKO.1-puro-TurboGFP 共转染。为了增量荧光效酶路透社基因慢速功能性实为型大肠杆菌，将 HEK293T 巨炎细胞与对此 SARSCoVS 酶或 SARS-CoV-2S 酶的核醛、pCMVΔR8.2 和 pLTR-Tat-IRES-Luc 顺利进行共转染。转染后 48 每隔查阅大肠杆菌上清液，离心浓缩，−80℃ 保留。野生型 SARS-CoV-2 大肠杆菌 (Isolate USA-WA1/2020) 由 BEI Bioresources (Manassas，VA) 提供者。pHW-NAGFP (ΔAT6) 简报基因核糖体和 A/WSN/1933 H1N1 共通核糖体 pHW2000-PB2、pHW2000-PB1、pHW2000-PA、pHW2000-HA、pHW2000-NP、pHW2000-NA、pHW20000M 由 FengLi 麻省理工学院友好提供者。在肺炎大肠杆菌 A-GFP 路透社基因相对论功能性合成中都，将 pHW2000-pb2、pHW2000-pb1、pHW2000-PA、pHW2000-ha、pHW2000-np、pHW2000-na、pHW2000-m、pHW2000-ns 和 pHW-NA-GFP 共转染 HEK293T 巨炎细胞 (ΔAT6)。48 每隔后查阅大肠杆菌上清液。SARS-CoV-2S、M、E、N 对此核醛澳大利亚进口 Sinobiological。利用 Twist Bioscience 裂解了 Ha-CoV-2(Luc) 核醛和 S 酶相异核醛。Ha-CoV-2(Luc) 和 S 酶相异相对论功能性按照左边描绘方式[31] 顺利进行合成。

大肠杆菌细菌感染和本品消除测试

RDS(欲求肺毒口服液)(来自 Dejia Harmony 还给，利斯堡，密西西比州) 是由马麻省理工学院实验者室 (Burnaby，BC，Canada) 生产的一种零售业商品。RDS 中都所有中都中草药组分原则上符合《中都国药典 2015 年版》「饮片」标准，除此以外适当组分含量及重金旧称、化肥限量样品。RDS 是一种制剂的共煎剂，事与愿违产物在真空条件下蒸发。SARS-CoV-2 抗病毒血清由 LanceA. Liotta 医生提供者。将曼尼朵尔盐醛盐 (Sigma) 新的悬浮在二的大基亚砜 (Sigma) 中都。对于实为型大肠杆菌细菌感染，12 孔板中都的 A549(ACE2) 巨炎细胞 (来自 Virongy LLC 还给，埃尔迪亚，密西西比州) 或 VeroE6 巨炎细胞用 RDS 模板 30 分钟，在 37℃ 下细菌感染 4-6 每隔，然后在新鲜养成基中都浇养成 48-72 每隔。对于 VeroE6 巨炎细胞的细菌感染，巨炎细胞也被 CoV-2 实为型大肠杆菌细菌感染减慢剂 (CoV-2PIE) (来自 Virongy LLC 还给，埃尔迪亚，密西西比州) 模板后，在 37°C 下先执行 30 分钟。应用于 GloMaxDiscover 酶标祯 (Promega) 比对巨炎细胞裂解物的荧光效酶已逝功能性。对于野生型 SARS-CoV-2 细菌感染，VeroE6 巨炎细胞在 37°C 下用 RDS 模板 30 分钟，然后用 MOI 为 0.05 细菌感染 SARS-CoV-2 (Isolate USA-WA1/2020；BEI Bioresources) 在乔治沃恩的学校的 BSL-3 收容服务设施内停留 1 每隔。巨炎细胞用 PBS 浇 2 次，用含 RDS 的养成基养成 48 每隔。从上清中都所含大肠杆菌，用 12 孔板养成的 Vero 巨炎细胞单层中都的炎菌斑测试推算出小瓶滴度。简言之，每个样品在值得注意的 Dul-becco's ModifiedEagle 养成基 (VWR) 中都合成，构成 1X 口服-阿司匹林 (VWR)，并加进 10% 的 FBS(赛默飞世尔高科技 Thermo Fisher Scientific)。然后将 200 微升的每种液态液吸附到 VeroE6 巨炎细胞单层的三个平行孔上 1 每隔。然后用 1～2 ml0.6% 罗济夫糖 (Invitrogen) 和一部分值得注意的 Eagle Minimal Essential 养成基 (VWR) 的液态覆盖面积单层，含 1X 口服-阿司匹林，并加进 10%FBS。48 每隔后，将单层膜单独在 10% 的大醛氢氧化钠中都 1 每隔，并去除覆盖面积的罗济夫塞。为了上色深褐色，自组所含 20% 混合物的 1% 固体紫上色剂氢氧化钠 5 分钟，然后用去离子水浇。对于病毒功能性肺炎大肠杆菌细菌感染 MDCK 巨炎细胞，在 37°C 下用 RDS 模板 30 分钟，然后用 A-GFP 路透社基因大肠杆菌细菌感染 6 每隔。用含 RDS 的养成基浇巨炎细胞，养成 36 每隔。GFP 对此通过流双管巨炎细胞祯一原理。(FACSCalibur，BD Biosciences).

对于 SARS-CoV-2 大肠杆菌基质的 RDS 灭已逝测试，将 100μl 近十年液态的 RDS 加进到 1 mlSARS-CoV-2 大肠杆菌原液 (3.65×105PFU/ml) 中都，事与愿违 RDS 液态为 1:20，1:40 或 1:80。也除此以外对应条件 (1 ml 大肠杆菌+100μl 养成基)。液态在 37°C 下养成 1 每隔。随后，对液态顺利进行第三部液态以激发额外的 1:10、1:100、1:1,000 和 1:10,000 液态度，并将近十年液态的样品自组 12 孔板中都的 Vero 巨炎细胞中都，可用顺利进行炎菌斑推算出比对。深褐色推算出中都事与愿违的 RDS 液态度为 1:200 至 1:200,000；1:400 到 1:400,000；和 1:800 到 1:800,000 的 RDS 液态液。

Ha-CoV-2(Luc) 和 S 酶相异相对论功能性按照左边描绘的方式[31] 合成。对于 Ha-CoV-2(Luc) 的 RDS 灭已逝，将 5μl 近十年液态的 RDS 加进到 45μlHa-CoV-2(Luc) 或则有中都，事与愿违 RDS 液态度为 1:20、1:40、1:80、1:160 或 1:320。将液态在 37°C 下养成 1 每隔，然后在 RDS 发挥作用下细菌感染 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) 巨炎细胞 12 每隔。应用于 GloMax Discover 酶标祯 (Promega) 比对巨炎细胞裂解物的荧光效酶已逝功能性。

巨炎细胞有毒比对样品

用的大醛丙啶上色和流双管巨炎细胞练成二阶对 A549 (ACE2) 巨炎细胞和 VeroE6 巨炎细胞的本品巨炎细胞有毒顺利进行样品，如所述 (34)。应用于巨炎细胞增殖盐醛盒 I(MTT) (Sigma) 和制造商劝告的方案对 MDCK 巨炎细胞的本品有毒顺利进行二阶。简言之，将 MDCK 巨炎细胞 (ATCC) 以每孔 1×-105 个巨炎细胞的速度接种到 12 孔板中都。巨炎细胞养成隔夜后，通过 RDS 执行 1 天，然后在 MTT 上标盐醛 (Sigma) 的养成基中都养成。将巨炎细胞与上标盐醛共同养成 4 每隔，先后续自组 MTT 增氢氧化钠。养成皿孵育过夜，用 GloMax Discover 酶标祯 (Promega) 推算出吸光度。

缩写

SARS-CoV：不堪重负急功能性气管系统综合症特别冠状大肠杆菌；SARSCoV-2：Severe 不堪重负急功能性气管系统综合症特别冠状大肠杆菌-2；TCM：传统习俗制剂；RDS：气管道排毒口服液；Ha-CoV-2：混杂病毒功能性新冠大肠杆菌实为大肠杆菌。

致谢

来向 FengLi 提供者肺炎大肠杆菌对此核醛，来向 LanceLiotta 提供者抗病毒毒血清；来向 TedCi，HeSun，ZhigangGao，WanyingWu 的争论与劝告；来向 KevinCarter、MarkMamdar、RichKeurajian、KarenFreidouni 提供者 RDS 和中草药精油。

原作者助益

此次实验者由 Y.W.，R.H. 和 L.A.H. 设计，由 Y.W. 撰稿，由 L.A.H. 编辑。B.H.，D.Y.，A.A.O.，L.D.C.，S.H.，D.D、GA 及 YM 执行了该实验者。所有原作者已朗读并批准事与愿违稿件。

资金

本研究工作的资金来自于乔治沃恩的学校内部拨给 223741(DeJiaHarmony/Anti-SARS-CoV-2)，该余款由德佳和畅 (DeJiaHarmony) 提供者。

数据和材料的可用功能性

本研究工作中都激发或比对的所有数据原则上构成在本文中都。盐醛可从 Y.W 处获取。

声明

批准及作准备提议

不限于

提议出版

不限于

竞争私利

乔治沃恩的学校国家所生物防御和疟疾中都心的 RMH 和 YW 已获得了德佳和畅 (DejiaHarmony) 的研究工作资助，LAH 为德佳和畅担任主管并获得了酬金。并未其他联系或社交已逝动或许就会影响到劝告书的工作。

原作者除此以外

1澳大利亚密西西比州乔治沃恩的学校系统生物学学院国家所生物防御和疟疾中都心，埃尔迪亚 20110。

2VirongyLLC，密西西比州埃尔迪亚。3加拿大伯纳比，BCV5J0E5 马麻省理工学院实验者室 (Dr.Ma's LaboratoriesInc.)。4 澳大利亚密西西比州利斯堡世界卫生自然科学该组织，20176。

收稿日期：2021 年 4 月末 7 日

接受日期：2021 年 5 月末 10 日

线上出版时间：2021 年 5 月末 29 日

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